拉曼光譜結合螢光生命期顯微術 (Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)一種新的分析工具
螢光材料具有特徵壽命，在該壽命期間，光與樣品相互作用後會發出螢光。 基於此壽命測量的成像稱為螢光生命期顯微術 (FLIM)。
Renishaw的 inVia 拉曼顯微鏡結合螢光生命期顯微術，可以獲得螢光生命期的空間圖像。 FLIM 圖像可以在同一坐標系上與相應的拉曼圖像一起生成。 這使得像素到像素的關聯變得簡單而直接。 FLIM 圖像的獲取速度至少比拉曼圖像快 10 倍； 這使其成為識別感興趣區域以進行後續拉曼測量的理想技術。
FLIM 特別適用於細胞生物學研究，可用於環境、監測分子相互作用和螢光團識別。
圖 1. 拉曼和 FLIM 光束路徑使用相同的光學佈置，並且具有同軸光束路徑，可以輕鬆實現像素到像素的關聯。
Renishaw inVia 拉曼顯微鏡結合螢光生命期顯微術
螢光生命期顯微術, FLIM 數據是使用具有相關定時電子設備的單光子檢測器收集，這種技術稱為時間相關單光子計數 (timecorrelated single photon counting, TCSPC)。 脈衝激光激發螢光後，通過確定相對於激發脈衝的螢光到達檢測器的時間來測量螢光壽命。而對於成像方面，inVia 顯微鏡的高精度 MS30 顯微鏡載物台在顯微鏡物鏡下移動樣品。 MS30 可實現大至 112 mm x 76 mm 的相關拉曼 FLIM 圖像，用戶定義的步長小至 50 nm。
FLIM 光學設置圖如圖 1 。光路和映射階段硬體與用於拉曼成像的硬體相同。 因此，FLIM 和拉曼成像模式之間的切換是完全自動化的，並且通過選擇合適的激光器和檢測器來實現。 該選擇在 Renishaw WiRE™ 軟件中執行，無需額外校準。 可以使用雷尼紹的 WiRE 軟體從與 FLIM 圖像相同的區域獲取拉曼圖像。 由於拉曼和 FLIM 光束路徑是同軸的，因此可以通過像素到像素的相關性精確地疊加圖像。
FLIM 圖像受益於使用拉曼系統衍射光柵控制螢光光譜範圍的能力。 這是在不需要額外的濾鏡或硬體的情況下實現的。 完全以軟體操作，不需要任何額外的校正。
例 1：藥錠的 FLIM 和拉曼成像
圖 2 顯示了切片鎮痛藥片的 FLIM 和拉曼圖像。 FLIM 圖像是使用頻率為 20 MHz 的脈衝 405 nm 雷射光生成的，拉曼圖像是使用 532 nm 連續波雷射光生成的。 在此測量中，拉曼圖像揭示了存在阿司匹林、對乙酰氨基酚和咖啡因的區域，以及拉曼信號以自發螢光為主的區域（圖 2b - 黑色代表拉曼條帶不可見的區域）。 這些自發螢光區域在 FLIM 圖像中可見，突出了 FLIM 和拉曼成像的高度互補性。
圖 2. Anadin® 藥錠的 FLIM/Raman 組合圖像。(a) 僅 FLIM 圖像 (b) 僅拉曼圖像（阿司匹林 - 紅色，對乙酰氨基酚 - 綠色，咖啡因 - 青色）（c）疊加的 FLIM 和拉曼圖像。
例 2：鈴蘭的 FLIM 成像
圖 3 顯示鈴蘭根莖的橫截面在 2-3 ns 之間觀察到的螢光生命期顯微影像。
這些圖像中顯示的圓形結構是維管束，可將水和養分輸送到植物的不同部位。 這些結構的螢光壽命比其他鈴蘭屬短。Renishaw可以分辨1n秒的螢光生命期顯微影像
圖 3. 鈴蘭樣品的 0.25 毫米 x 0.25 毫米區域的 FLIM 圖像。
圖 4 顯示具有更大面積 1 mm x 1mm 的 FLIM 圖像。由於 FLIM 數據採集速度快，可以高達 4 mm/s 的速度掃描樣品。 inVia 顯微鏡還可實現低至 ~300 nm 的高空間分辨率。
圖 4. 鈴蘭樣品的 1 毫米 x 1 毫米區域的 FLIM 圖像。
提高靈活性的組合系統
通過將 FLIM 模組添加到 inVia 拉曼顯微鏡，您可以輕鬆地直接關聯拉曼和螢光生命顯微圖像。 這使您能夠以高空間分辨率分析一系列結構和化學特性，為生物成像中的一系列應用提供關鍵資源。
